專題分享

非洲豬瘟疫苗新契機(上)

基因缺損非洲豬瘟疫苗開發

農業科專服務小組/楊舜堯 專案經理

非洲豬瘟疫情與疫苗開發困境

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)是種只會感染豬的DNA病毒,不會感染人類,但因為傳染性高、死亡率高以及可長存於環境中(豬舍1個月、糞便室溫11天、冷藏100天、冷凍1,000天),能造成養豬產業龐大的損失。非洲豬瘟最早起源於非洲肯亞,陸續傳播到歐洲與俄羅斯等地區,並在2018年於中國爆發,目前東亞地區僅剩臺灣和日本尚未成為疫區(中央災害應變中心,2020)。目前仍無法有效預防或治療非洲豬瘟,因此歐洲與中國等國家都持續投入研究能量設法解決非洲豬瘟的問題。

圖1、國際非洲豬瘟疫情現況。

▲ 圖1、國際非洲豬瘟疫情現況。(中央災害應變中心,2020年2月17日)

已有文獻指出,無法開發出有效疫苗是非洲豬瘟疫情難以控制的最大原因(Arias et al.,2018)。非洲豬瘟疫苗仍未發成功的原因如下(Barasona et al.,2019,張猷忠,2019):

  1. 對於非洲豬瘟的感染機制與宿主免疫關係仍不完全了解。
  2. 非洲豬瘟基因型複雜,不同病毒株誘發的抗體不具有交叉保護作用。
  3. 還未找到能誘發廣效性與交叉保護作用的病毒抗原,難以開發中和抗體。
  4. 缺乏穩定的細胞株(cell line)技術,目前實驗室培養非洲豬瘟病毒都是從活豬上採取新鮮細胞培養,批次品質不一致且成本高昂,不適合作為疫苗生產使用。

目前非洲豬瘟疫苗的開發主要方向為:次單位疫苗(subunit vaccine)、不活化疫苗(inactivated vaccine)以及減毒活疫苗(live attenuated vaccine)。次單位疫苗是將病毒的部分組成分純化而成的抗原,並非完整病毒,但非洲豬瘟病毒共含有多達167種蛋白質,難以挑選適合抗原,因此目前實驗結果中,次單位疫苗尚無法誘發完整的免疫效果。不活化疫苗是指死病毒所做成的疫苗,因為非洲豬瘟病毒結構具有多層殼膜(圖2)以及殼膜上含有多種蛋白質,大幅增加感染機制的複雜度,使不活化疫苗無法提供有效保護功能。減毒活疫苗是經處理後讓毒性減弱的活病毒,目前已有研究開發出能提供保護力的減毒活疫苗,但仍有缺乏交叉保護作用或出現慢性症狀等副作用的情形,不過,因為能透過遺傳工程刪去(deletion)部分基因來改善這些問題,減毒活疫苗被視為最具有可行性的非洲豬瘟疫苗策略。

圖2、非洲豬瘟病毒具有多層殼與膜結構。

▲ 圖2、非洲豬瘟病毒具有多層殼與膜結構。(Freitas and Lyra, 2016)。

美國政府的非洲豬瘟疫苗開發

隸屬於美國農業部的農業研究署(Agricultural Research Service)團隊嘗試開發非洲豬瘟疫苗,選擇目前歐亞地區主要流行的非洲豬瘟喬治亞病毒株(ASFV-G)作為研究對象。研究人員挑選一段存在於大多數非洲豬瘟病毒株DNA中的基因I177L,且不同來源的病毒株所表現出此基因之氨基酸序列一致性程度高。目前推測I177L所表現出的蛋白質結構中可能含有跨膜結構(transmembrane helix),而I177L的功能仍尚未被確認。

為了確定I177L基因與非洲豬瘟病毒致病性的關聯,美國農業研究署團隊以分子技術在非洲豬瘟病毒株ASFV-G的I177L基因片段中插入另一段螢光蛋白基因將其破壞,成為基因缺損的病毒株ASFV-G-ΔI177L。接著以豬的巨噬細胞分別培養ASFV-G與ASFV-G-ΔI177L觀察差異,發現ASFV-G-ΔI177L組別的病毒力價低於ASFV-G組,代表破壞I177L基因可以降低非洲豬瘟病毒的複製能力,成為非洲豬瘟的弱病毒株,具有成為減毒活疫苗潛力。

研究團隊下一步進行動物實驗來評估ASFV-G-ΔI177L在豬隻上的毒性,動物實驗選在位於離島上的梅島動物疾病中心(Plum Island Animal Disease Center)執行。實驗分成兩組,豬隻分別接種同劑量ASFV-G與ASFV-G-ΔI177L進行觀察,強毒性ASFV-G組的豬出現體溫上升、精神不濟、皮膚發紺及下痢等典型症狀,隨後豬陸續死亡或重症接受安樂死。相反地,弱毒性ASFV-G-ΔI177L組的豬都存活到實驗結束且未出現非洲豬瘟臨床症狀。此外,在實驗期間抽血進行血球吸附試驗,兩個組別都出現病毒血症,表示血液中有病毒存在,但ASFV-G-ΔI177L組豬隻的數據相較輕微,證明刪去I177L可以有效降低非洲豬瘟病毒的毒性。第二階段的動物實驗則將檢驗這種弱化病毒是否有潛在毒性,於是分別注射低、中、高劑量的ASFV-G-ΔI177L病毒株來測試對豬隻的影響。結果三種劑量的實驗組豬隻都存活且也未出現非洲豬瘟臨床症狀,證明了這種弱毒性病毒的安全性。

後續進行動物的挑戰實驗,研究人員再將原始的強毒性ASFV-G病毒株接種到先前接受過弱毒性ASFV-G-ΔI177L病毒株試驗的豬身上,結果所有豬隻都存活且沒有產生非洲豬瘟的臨床症狀,證明將非洲豬瘟病毒刪去I177L基因後的弱毒性病毒能提供豬隻保護力,具有成為非洲豬瘟疫苗的潛力。

雖然對於非洲豬瘟病毒的致病機制與I177L基因功能仍然不是完全了解,但美國農業研究署的透過細胞實驗、動物實驗及挑戰實驗,依序證實刪去這段基因能夠降低病毒毒性,成為具低傳染力、高安全性,以及低劑量即可提供保護力的減毒活疫苗。目前對於肆虐歐亞地區的ASFV-G病毒株仍無其他有效疫苗的研究,本研究成果可為非洲豬瘟疫情帶來一絲曙光。

臺灣亦有投入相關資源在畜產動物疫苗研究上,例如瑞寶基因股份有限公司在2009年執行農業業界科專計畫,開發雞隻的新城雞病、家禽里奧病毒及產蛋下降症候群之混合不活化疫苗,另外也與農科院合作開發PCV2、PRRSV、CSFV等豬病疫苗,近期則進行非洲豬瘟的次單位疫苗取得初步成果(工商時報,2019)。臺灣面臨非洲豬瘟的威脅,除了防疫政策之外,若能在疫苗開發上取得成果,將更能保障養豬產業的發展。

參考資料

  1. Arias, M., A. d. l. Torre, L. Dixon, C. Gallardo, F. Jori, A. Laddomada, C. Martins, R. M. Parkhouse, Y. Revilla, F. Rodriguez, and J. M. Sanchez-Vizcaino.2017. Approaches and perspectives for development of African swine fever virus vaccines. Vaccines,5,35.
  2. Borca, M. V., E. Ramirez-Medina, E. Silva, E. Vuono, A. Rai, S. Pruitt, L. G. Holinka, L. Velazquez-Salinas, J. Zhu, and D. P. Gladue.2020. Development of a highly effective African swine fever virus vaccine by deletion of the I177L gene results in sterile immunity against the current epidemic Eurasia strain. Journal of Virology, JVI.02017-19.
  3. Forth, J. H., L. F. Forth, J. King, O. Groza, A. Hübner, A. S. Olesen, D. Höper, L. K. Dixon, C. L. Netherton, T. B. Rasmussen, S. Blome, A. Pohlmann, and M. Beer. 2019. A Deep-Sequencing Workflow for the Fast and Efficient Generation of High-Quality African Swine Fever Virus Whole-Genome Sequences. Viruses, 11, 846.
  4. Freitas, T. R. P., and T. M. P. Lyra.2018. Molecular studies on African swine fever virus from Brazilian isolates. Arq. Inst. Biol., v.85, 1-8, e0712016.
  5. 中央災害應變中心非洲豬瘟資訊專區。https://asf.baphiq.gov.tw/ws.php?id=17888
  6. 張猷忠。2019年。淺談非洲豬瘟-防疫與疫苗開發的重重關卡。科學月刊590期。
  7. 教育部顧問室「生物技術科技教育改進計畫」。2005年。疫苗發展技術與實驗。
  8. 工商時報。2019年。瑞寶豬瘟疫苗保護力估達6成。